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IDEHU-Instituto
de Estudios de la Inmunidad humoral (CONICET-UBA)
Director:
Prof.
Emer. Dr. Ricardo A. MARGNI
Junín
956, 4to piso.
(1113)-Buenos Aires. ARGENTINA
(54-11) 4964 8259/60
ramargni@ffyb.uba.ar
Proyectos
principales en curso:
Proyecto
1
Inmunología
de la reproducción. Los anticuerpos IgG asimétricos en la
protección del feto
Descripción
breve
El
individuo en gestación hereda la información genética de
sus progenitores adquiriendo la capacidad de expresar
diferentes antígenos de origen materno y paterno. A pesar de
la naturaleza semialogeneica que es reconocida por el sistema
inmune materno, en condiciones normales el feto no es
rechazado.
Aunque
este principal interrogante de la Inmunología de la
Reproducción no ha sido esclarecido totalmente, hoy en día
se atribuye el éxito de la preñez a la acción conjunta de
varios mecanismos; es por ello que nuestro proyecto de
investigación tiene como objetivo general realizar aportes
referentes a este tema y centralizar nuestra atención en el
estudio de las moléculas de IgG asimétricas como protectoras
del feto en una preñez normal.
En
estos últimos años se ha enfatizado el rol central de las
citoquinas en la respuesta inmune. Se considera que un perfil
de citoquinas Th1 proinflamatorias, inductoras de linfocitos T
citotóxicos (CD8+), está asociado al fenómeno de rechazo,
en tanto que el perfil de citoquinas Th2, inductor de
actividad de linfocitos B, producción de anticuerpos, y de
linfocitos T no citotóxicos (CD4+) está asociado a la
tolerancia inmunológica. Durante la preñez, en la interfase
feto-materna, un cambio en el perfil de citoquinas, con
predominio de las de tipo Th2,
favorecería la protección del feto.
La
placenta juega un rol importante durante la preñez,
secretando factores inmunomoduladores que aseguran la
supervivencia de la unidad feto-placentaria; éstos aún no
han sido identificados en su totalidad, muchos de ellos son
citoquinas y hormonas.
Teniendo en cuenta estas consideraciones uno de los
objetivos de nuestro grupo de investigación
es estudiar el mecanismo de acción glucosilante de los
sobrenadantes de cultivos de placentas y de hormonas sexuales
y determinar la participación de la interleuquina 6 (IL-6)
en este proceso, especialmente en lo que a moléculas
de IgG se refiere, ya que éstas son bloqueantes, protectoras
del antígeno.
En
los últimos años fueron descriptas proteínas genéricamente
denominadas chaperaonas moleculares que intervienen en los
procesos de plegamiento y glucosilación intracelulares, por
lo que sería importante esclarecer si los factores
placentarios y en particular la IL-6 podrían inducir
modificaciones en su síntesis. Los resultados a obtener tendrían
relevancia en el campo de la salud ya que permitirían
profundizar los conocimientos referidos a la respuesta inmune
materna durante la preñez. El desvío de esta respuesta hacia la síntesis
preferencial de anticuerpos IgG asimétricamente glucosilados
protectores del feto, constituiría un potencial tratamiento
preventivo de abortos espontáneos recurrentes.
Proyecto
2
Concepto
moderno sobre formulación de vacunas contra tétanos,
difteria y pertussis
Descripción
breve
En
los últimos años hemos asistido a un progreso impresionante
en el campo de la inmunología y biología molecular, lo cual
ha permitido un mejor entendimiento de las interaciones que
ocurren entre microrganismos y sus hospedadores. Este
conocimiento básico, obliga a la revisión de las vacunas
tradicionales que fueran diseñadas a parrtir de resultados
empíricos, es decir, desconociendo
tanto los mecanismos de patogénesis de las enfermedades como
los de las respuestas inmunes. Nuestro grupo de trabajo
demostró que la conocida respuesta neutralizante antitetánica
de tipo humoral (Th2, no inflamatoria) originada por la vacuna
DT o DTPa (antígenos solubles) se modifica en el caso de las
vacunas DTPw y DTSt (antígenos particulados) al
activarse también una respuesta Th1 con producción
innecesaria de citoquinas pro-inflamatorias como IL-2, INFg
e IL-6.
También
demostramos que la nueva vacuna DTPa, de menor reactogenicidad
que la tradicional (DTPw), es incapaz de generar la respuesta
Th1 necesaria para eliminar B.
Peertussis (patógenio intracelular).
Actualmente, se analiza la efectividad de un plan de
vacunación alternativo que emplea a los antígenos
componentes de ambas vacunas pero asociados de diferente
manera.
La idea es generar una respuesta inmune adecuada para
cada uno de los componentes, evitando la producción
uinnecesaria de citoquinas pro-inflamatorias para el caso de tétanos
y difteria y logrando una respuesta protectiva para pertussis
con una mínima cantidad de exposiciones al componente
bacteriano entero, que si bien es usado hoy en día , es de
conocida reactogenicidad
Proyecto
3
Caracterización
de un antígeno purificado de. Cruzi. Importancia en la
infección y en la respuesta inmune desencadenada por el huésped
Descripción
breve
En
nuestro laboratorio se ha purificado por cromatografía de
afinidad con un AcMo, un Ag específico de T.cruzi, Ag163B,
que presenta identidad inmunológica con la cruzipaína. Dadas
las características relevantes de este antígeno nos
proponemos ampliar los estudios de especificidad diagnóstica
del antígeno estudiando sueros de pacientes leishmaniásicos
de Oran, Salta.
Confirmaremos por PCR la infección chagásica en
algunos de estos pacientes. Estudiaremos perros de la zona
para comprobar si actúan como reservorios de la enfermedad.
Analizaremos si la PCR,
comparativamente con el hematocrito, puede contribuir
al diagnóstico de enfermedad de Chagas en bebés congénitamente
infectados y en el seguimiento del tratamiento con Beznidazol.
Completaremos la caracterización inmunoquímica del Ag y
analizaremos el sitio de unión del AcMo que utilizamos para
purificarlo.
Comprobaremos si el Ag163B tiene participación en la
penetración del
parásito en la célula huésped y si el AcMo puede
bloquear dicha penetración en ensayos in
vitro.
En ensayos in
vivo en el modelo murino realizaremos inmunizaciones
pasivas con el AcMo y activas con el Ag163B para comprobar la
capacidad protectora de ambos frente al desafío con
tripomastigotes de T. cruzi . Estudiaremos las citoquinas
inducidas por inmunización con el Ag y trataremos de conducir
la respuesta inmune predominantemente hacia Th1, empleando
como adyuvante oligonucleótidos CpG
Proyecto
4
Interacción
y estructura tridimensional del TCR, Superantígenos y
moleculas del CMH
Descripción
breve
El
receptor para antígenos de los linfocitos T (TCR), tiene una
importancia central en las etapas de reconocimiento, efectora
y reguladora de la respuesta inmune. Por ello se estudiará la
cinética de las interacciones y la estructura tridimensional
del TCR y de los complejos formados por éstos con Superantígenos
y moléculas del CMH. Para ello se producirán y
purificarán cadenas b
solas y la porción rxtramembrana de diferentes TCR
recombinantes (Vb8.2, Vb5.2 y Vb15), moléculas de
claase I y II del MHC y de los superantígenos (SAgs)
bacterianos SEC1-3, ETA, TSST-1 y SSA. Se resolverá la
estructura tridimensional e identificarán los sitios de unión
mediante la obtención de cristales adecuados para los
estudios de difracción de rayos X. Este conocimiento,
unido a los estudios de cinética de la interacción empleando
BIAcore de estas moléculas así como de los mutantes
obtenidos con el objeto de modificar su afinidad, permitirán
diseñar derivados con el objeto de manipular la
respuesta inmune en vacunación, en el tratamiento de
enfermedades autoinmunes o infecciosas y en la terapia del cáncer.
Proyecto
5
Estudio
de la influencia de la radiación ultravioleta B (UVB) en el
desarrollo de enfermedades autoinmunes cutáneas. Probable
participación de los autoanticuerpos anti-ribonucleoproteas
Ro/SSA
Descripción
breve
Las
radiaciones ultravioletas (RUV) y en especial las del rango
UVB (290-320 nm) son un factor ambiental en la inducción y
promoción de tumores. También las RUV se han relacionado en
el desencadenamiento de lesiones cutáneas en enfermedades
autoinmunes del grupo lupus eritematoso (LE).
No se conocen con claridad los mecanismos mediante los
cuales las RUV desencadenan lesiones en los distintos tipos de
LE; no obstante la aparición de lesiones se han relacionado
con la presencia en suero de autoanticuerpos contra
ribonucleoproteínas Ro/SSA. Uno de los hallazgos caracerísticos
de las lesiones de LE es la presencia de depósitos de
anticuerpos en la zona de membrana basal epidérmica (banda lúpica),
siendo esta una de las formas mas específicas de diagnóstico.
Existen
dos tipos de anticuerpos anti-Ro/SSA que reconocen distintas
proteínas integrantes del complejo Ro/SSA, denominadas Ro/SSA
52 y 60 kDa. Existen, no obstante situaciones en las cuales
los pacientes que presentan estos autoanticuerpos circulantes,
carecen de lesiones fotoinducidas como el caso del Síndrome
de Sjögren (SS). Si bien existen numerosas referencias en la
literatura sobre los epitopes reconocidos por los
autoanticuerpos en los distintos tipos de LE y en SS, no es
clara la relación patogénica entre las distintas
especificidades de estos anticuerpos.
Se
ha comprobado que las UVB pueden producir cambios en la
distribución celular de ribonucleoproteínas, entre ellas los
componentes del complejo antgénico Ro/SSA. Durante el proceso
de apoptosis inducida por UVB los Ro/SSA son expuestos en
forma de vesículas de membrana. El clivaje de Ro/SSA mediado
por caspasas (cistein proteasas) durante la apoptosis puede
inducir la exposición al sistema inmune de epitopes crípticos
o neoepitopes.
Los
objetivos del presente proyecto cubren los siguientes
aspectos: i. el estudio de las características fisicoquímicas
de los anticuerpos anti Ro/SSA en LE y SS; ii. la interacción
de estos anticuerpos con células epidérmicas irradiadas en
modelos in vitro (células HaCat) e in vivo (ratones cepa
Hairless-skh1); iii. evaluación de los mecanismos moleculares
desencadenados durante la apoptosis inducida por UVB; iv. el
estudio de genes expresados en forma diferencial evaluados por
hibridizacion substractiva.Se espera que los resultados
obtenidos durante el desarrollo del presente proyecto permitan
explicar los mecanismos involucrados en la aparición del
fotodaño y su relación con este tipo de autoanticuerpos.
Estos resultados servirán para el establecimiento de nuevas
medidas terapéuticas y preventivas en estas enfermedades
autoinmunes con una alta morbi-mortalida
Proyecto
6
Purificación
y caracterización de las subclases de IgG en camélidos
sudamericanos
Descripción
breve
Las
inmunoglobulinas (Igs) son consideradas una poderosa
herramienta para el reconocimiento de moléculas con un alto
grado de afinidad y especificidad. Están formadas por dos
cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L), que se hallan
unidas entre sí mediante puentes di-Sulfuro (di-S)
inter-catenarios e intra-catenarios y uniones hidrofóbicas,
wan der Walls y puentes H. Cada cadena está organizada en
dominios. Las cadenas L y H poseen un dominio variable en el
amino-terminal (VL y VH respectivamente); en el
carboxilo-terminal la cadena L presenta un dominio constante
(CL), mientras que la cadena H de las IgG, IgD e IgA posee
tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3); la IgM e IgE poseen
un dominio más. En las regiones VH y VL se halla el sitio de
unión al antígeno, denominado sitio de combinación del
anticuerpo, formado por 6 zonas de hipervariabilidad: 3 en el
VH y 3 en el VL. Tanto las regiones variables como cada uno de
los dominios constantes, tienen una longitud aproximada de 110
aa y presentan un plegamiento idéntico que se lo conoce como
"plegamiento de las Igs". Gracias a este
plegamiento, todos los CDR espacialmente se hallan muy
cercanos entre sí. Las cadenas livianas son solubles en
medio salino, es decir que son altamente hidrofílicas, pudiéndose
hallar libres en el suero de los diferentes mamíferos. En
cambio, las cadenas H son insolubles en solventes salinos por
lo tanto es imposible encontrarlas libres en el suero.
En
función de lo dicho, era imposible imaginar un anticuerpo
formado sólo por cadenas pesadas, hasta que a principios de
los 90’, Haremans-Casterman C. describieron las Igs de
dromedarios, indicando en el suero de estos animales la
existencia de una sustancial proporción de Igs formadas sólo
por dímeros de cadenas H (IgGHH) y sin el dominio CH1, siendo
su solubilidad y afinidad muy similar a la de las IgGs
normales (IgG H2L2). (Hamers-Casterman C. y col., 1993)
Estudios cristalográficos de la región VH de camélidos
indican claramente que presenta el plegamiento típico de las
Igs, que se halla totalmente conservado, debido a que los aa
cruciales para tal plegamiento se hallan conservados, con
respecto a los de otras especies. Todas estas sustituciones
explican de alguna manera los motivos por los cuales es
posible pensar en anticuerpos formados únicamente por dos
cadenas pesadas a las que le falta el CH1. A pesar de la
ausencia de la cadena L, se ha demostrado que estas Igs
interactúan con su antígeno con alta afinidad y
especificidad, por lo tanto, estas moléculas son
extremadamente útiles para su aplicación biomédica.
Los
grandes avances de la biología molecular ha permitido el
desarrollo de librerías de genes para la producción de
fragmentos de Igs como ser scFv (formado por VH unido a VL por
un péptido de unión o "linker") y fragmentos Fab.
Sin embargo, era imposible de pensar en la construcción de un
fragmento más pequeño con capacidad de unirse a su antígeno
(el VH), debido a la insolubilidad de la cadena H y a la falta
de estabilidad que le debe conferir el VL.
Debido
a la importancia para el campo de la biotecnología médica,
de estructuras de anticuerpos formadas sólo por un único
dominio variable, en los últimos años las IgGs de camélidos
están siendo intensamente analizadas. Sin embargo, poco
se sabe aún acerca de la función, características inmunológicas
y concentración de esta peculiar subclase de
anticuerpos. Menos conocido aún es su comportamiento frente a
los diferentes agentes infecciosos y finalmente y cuál sería
su importancia en los animales que las producen.
El
presente proyecto está orientado hacia el estudio de estos
anticuerpos en el contexto de las especies que los sintetizan.
Los
objetivos son: i. Analizar en el suero de llamas (llama
glama) la presencia de subclases de IgG formadas sólo por
cadenas pesadas. ii. Purificación de todas las suclases de
IgG, para luego ser utilizadas en la obtención de los
respectivos antisueros. iii. Dichos antisueros serán
utilizados para el estudio de las características inmunológicas
de los respectivos isotipos y su comportamiento frente al
desafío de los animales con diferentes inmunógenos.
Proyecto
7
Antígenos
y anticuerpos en la predicción-prevención de la Diabetes
Mellitus asociada a autoinmunidad
Descripción
breve
Las
líneas de investigación científico-tecnológica abordan
temas básicos y aplicados en Inmunidad y Diabetes Mellitus
(DM). Ya se desarrollaron antígenos recombinantes naturales y
quiméricos de la enzima GAD65. Uno de esos productos
se aplicó a un test DELISA para configurar un prototipo de
kit analítico, útil
en la detección precoz de la DM Tipo 1 y variantes
Tipo 2. El proyecto culminó con patentes presentadas en la
Argentina y en EEUU. Con el apoyo de un subsidio trianual de
la programación de Crédito Fiscal (ANPCYT y Convenio
CONICET-IDEHU / Empresa), se realiza el clonado de genes y
expresión de fragmentos autoantigénicos de la fosfatasa
IA-2/ICA512, proteína que complementa el grupo de autoantígenos
de la DM.
La
parte aplicada incluye programas de “screening” de
marcadores inmunológicos en pacientes con DM y en sus
parientes en primer grado, como grupo de riesgo. Para la
detección precoz de la autoinmunidad anti-islote en adultos
con DM latente (LADA) o insulino-requirentes (DM Tipo 2-IR),
se desarrollan programas epidemiológicos y de control de
calidad para los tests, con impacto inmediato en Salud. Además
se forman recursos humanos afectados a la docencia teórico-práctica
en pre y postgrado.
Proyecto
8
Caracterización
de una proteína recombinante de Brucella: Estudios
estructurales e inmunológicos. Su aplicación al diagnóstico
de la brucelosis.
Descripción
breve
-
Se determinó que la proteína de 18 kDa aislada por nuestro
grupo posee actividad enzimática de lumazina-sintetasa.
-
Se pudo determinar la estructura tridimensional por difracción
de rayos X a 2,7 Å de resolución.
Esta proteína permanece en estado pentamérico en su
forma cristalizada . Si bien el ensamble macromolecular
difiere del de la lumazina-sintetasa de B. Subtilis el sitio
de unión de ambas es virtualmente idéntico a la estructura
de la proteína de 18kDa.
Esta característica abre la posibilidad de utilizar
las lumazin-sintetasas de bacterias de distintas especies como
blanco de inhibidores
farmacológicos que no interfieren con células eucarióticas.
-
Por otro lado hemos avanzado significativamente en el estudio
de la capacidad inmunogénica de la proteína recombinante de
18 kDa, tanto inoculada sola en forma solublecomo agregada,
con distintos adyuvantes. Dispara una fuerte respuesta humoral
con pefil Th1 o Th2 según sea su administración.
También genera respuesta celular específica aunque no
se ha logrado aún establecer si la respuesta generada resulta
protectora.
-
Los ensayos inoculando un plásmido codificante de esta proteína
han mostrado su capacidad de generar respuesta inmune específica
tanto humoral como celular.
Este sistema de vacunación con ADN mostró, en un
ensayo preliminar, conferir protección estadísticamente
significativa en un sistema murino.
-
Hemos obtenido resultados que indican que p18 es un antígeno
útil en pruebas de diagnóstico serológico de
la enfermedad en humanos, caprinos, caninos y bovinos.
- Por otra parte hemos iniciado estudios de la
respuesta inmune celular en pacientes infectados con Brucella,
en diferentes estadíos de la enfermedad, determinando in
vitro la capacidad proliferativa y los niveles de producción
o secreción de interleuquinas de tipo Th1 y Th2 por
leucocitos periféricos de dichos pacientes.
Proyecto
9
Triquinelosis:
mecanismos inmunológicos básicos de la relación
hospedador-parásito. Inmunodiagnóstico
Descripción
breve
El
proyecto incluye el estudio en triquinelosis de los mecanismos
inmunológicos básicos de la relación hospedador-parásito,
especialmente los involucrados en la protección del
hospedador, inmunomodulación, como así también de escape
parasitario con el fin de elaborar planes de inmunización
(vacunas) y el desarrollo de métodos de diagnóstico
precoces.
1-Mecanismos
inmunológicos efectores: mecanismos de acción de la/s
poblacion/es celular/es efectora/s y de los diferentes
isotipos de
Acs, antígenos involucrados, parámetros inmunológicos
en triquinelosis aguda y crónica y respuesta inmune en
mucosas.
2-
Mecanismos de evasión del parásito: variaciones antigénicas
parasitarias, antígenos compartidos entre estadíos e
inmunoglobulinas bloqueantes del mecanismo inmunológico
efector.
3-
Parasitosis y preñez: preñez como modelo de inmunoactivación,
estudio de los mecanismos inmunológicos efectores a nivel
intestinal y sistémico.
4-
Inmunodiagnóstico: se han desarrollado técnicas que permiten
garantizar la sanidad animal y realizar mejores estudios
inmunológicos en areas endémicas. Además se está
trabajando en el desarrollo de técnicas de diagnóastico
precoz de triquinelosis humana que permitan detectar la fase
intestinal y/o migrante del parásito.
Proyecto
10
Mecanismos
que participan en el crecimiento tumoral y en procesos
inflamatorios. Interacción CD44-AH, apoptosis, resistencia a
drogas
Descripción
breve
En
nuestro laboratorio se están investigando mecanismos que
participan en el crecimiento y la diseminación de células
tumorales (adhesión, migración e invasión) así como en la
infiltración de leucocitos durante la respuesta inflamatoria
producida como consecuencia de una injuria tisular. Estos
procesos se enfocan a partir del contacto de las células con
la matriz extracelular a través de la interacción CD44-AH.
El objetivo es determinar la participación de CD44-AH en el
tráfico y anclaje selectivo de células tumorales en
diferentes órganos, en la inducción de apoptosis y en la
patogénesis del proceso inflamatorio caracterizado por
infiltración de leucocitos, y su relación con la respuesta
inmune innata.
Se está investigando si isoformas particulares de
CD44, interactuando con metaloproteínas, podrían activar vías
de señalización que contribuyen al potencial invasivo o
migratorio de células tumorales o normales, respectivamente.
En los modelos tumorales se evalúa, además, la activación y
regulación del factor de transcripción nuclear NFkB así
como la presencia de proteínas que regulan la apoptosis y la
bomba de flujo de drogas, en lineas resistentes (MDR+) y
sensibles (MDR-) a vincristina y doxorubicina, obtenidas
previamente en nuestro laboratorio. Los resultados obtenidos
serán utilizados para diseñar terapias específicas que
modulen y mejoren patologías tumorales.
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